目的

學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的純度，DNA的構(gòu)型，含量以及分子量的大小。

原理

水平式瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中常規(guī)的實驗方法，它簡單易行，只需少量的DNA就能檢測，其分辨效果比分光光度計法與溴化乙啶-標(biāo)準(zhǔn)濃度DNA比較法更高，更直接，檢測DNA范圍更廣，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物；使得DAN發(fā)射的熒光，增強(qiáng)幾十倍。而熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品做瓊脂糖凝膠電泳的對照，就可比較出待測樣品的濃度。若用薄層分析掃描儀檢測，則可地測得樣品的濃度。電泳后的瓊脂糖凝膠塊直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA ，就可以從照片上比較鑒別。如肉眼觀察，可檢測到0.01~0.1ng的DNA。

在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比。質(zhì)粒DNA樣品用單一切點的酶酶切后與已知分子量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行電泳對照，觀察其遷移距離，就可以該樣品的分子量大小。凝膠電泳不僅可分離不同分子量的DNA，也可鑒別分子量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。在抽提質(zhì)粒的過程中，由于各種因素的影響，使得超螺旋共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA（SC）的一條鏈斷裂，變成開環(huán)（OS）分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就變成線形分子（L）分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋遷移速度快，其次為線形分子，慢的為開環(huán)分子。

當(dāng)提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA，在瓊脂糖電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可以分析樣品的純度。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)，前者由分子所帶凈電荷的多少而定，后者則主要與分子大小及構(gòu)型有關(guān)。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負(fù)電荷。在電場中向著正極移動，在用電泳法檢測DNA分子時，應(yīng)當(dāng)盡量減少電荷效應(yīng)。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應(yīng)，使得分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度差異所決定，提高分辨率。同時適當(dāng)降低電泳時的電壓，也可以使分子篩效應(yīng)相應(yīng)增強(qiáng)而提高分辨率。

試劑與器材

一、試劑

1、 DNA樣品

2、 TBE緩沖液（5×）：用時需稀釋10倍

3、 點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油

4、 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。

5、 瓊脂糖

二、器材

1、 電泳儀系統(tǒng)

2、 紫外燈

3、 恒溫水浴箱

操作步驟

1． 選擇合適的水平式電泳儀，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平，檢測穩(wěn)壓電源與正負(fù)極的線路。

2． 選擇孔徑大小適宜的點樣梳，垂直架在電泳槽負(fù)極的一端，使得點樣梳的底部與電泳槽水平面的距離為0.5~1.0mm。

3． 制備瓊脂糖凝膠：按照被分離的DAN分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。一般情況下可參考下表：

稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，一般配制約40ml 凝膠液，置微波爐中或水浴加

熱，至瓊脂糖融化均勻。

4． 將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，在一端插好梳子。待凝膠溶液冷卻至60℃

左右時，在凝膠溶液中加EB（EB終濃度為0.5 μg/ml），搖勻，輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。待凝膠*凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入TBE緩沖液），然后小心地拔掉梳子保持點樣孔完整。

注意：電極緩沖液要高出凝膠面2-5㎜。

5． 待測的DNA樣品中，加入1/5體積的點樣緩沖液，混勻后小心的進(jìn)行點樣，記錄樣

品點樣順序和點樣量。

6． 開啟電源開關(guān)，gao電壓不超過5V/cm。

7． 電泳時間看實驗的具體要求而異，在電泳中途可用紫外燈直接觀察，DNA各條區(qū)帶

分開后電泳結(jié)束。一般20min—3 h，取電泳凝膠塊直接拍照。