一、目的
掌握RNA提取的基本技術(shù)，了解RNA提取過(guò)程中的各種注意事項(xiàng)。
二、原理
RNA提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中難度較大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
RNA提取和DNA提取有類(lèi)似的地方，因?yàn)樗鼈兌际呛怂?，都具有較好的水溶性。提取RNA首先破碎細(xì)胞，然后用提取液將RNA溶出，反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)，加入乙醇沉淀RNA，將RNA沉淀溶解備用。那么如何區(qū)分DNA和RNA分開(kāi)？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的鹽溶液中具有hao的溶解度，而RNA在0.14M的鹽溶液中具有hao的溶解度，所以可以利用它們的溶解性將它們進(jìn)行區(qū)分。另外，RNA的分子量一般比較小，而DNA分子很大且和蛋白結(jié)合成復(fù)合體，所以DNA更容易隨蛋白沉淀，而RNA具有較好的溶解性。
RNA提取的另一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題就是如何抑制或去除環(huán)境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和鐵器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃過(guò)夜浸泡，然后濕熱滅菌80℃烘干備用。配制溶液所需的水也要用DEPC處理過(guò)的水，而配置Tris相關(guān)的緩沖液時(shí)Tris會(huì)與DEPC發(fā)生反應(yīng)，應(yīng)避免用DEPC處理。另外操作過(guò)程中應(yīng)戴手套。
判斷RNA 的質(zhì)量主要有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，一是純度，二是完整性（是否被降解）。RNA的純度可以通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定的A260／A280值來(lái)判斷。RNA的完整性主要通過(guò)電泳分析來(lái)闡明，未降解的總RNA電泳時(shí)在凝膠中會(huì)出現(xiàn)18S和28SrRNA對(duì)應(yīng)的條帶（如果有DNA污染則在RNA后會(huì)發(fā)現(xiàn)基因組DNA對(duì)應(yīng)的條帶）。RNA電泳系統(tǒng)也要嚴(yán)格對(duì)RNA酶進(jìn)行處理。如果用普通瓊脂糖凝膠電泳，則用盡量減少電泳時(shí)間。
三、試劑與器材
（一）試劑
1、暗培養(yǎng)7天的小麥苗，用前光照誘導(dǎo)3 h
2、DEPC
3、DEPC處理的ddH2O
4、RNA提取液：（每1000毫升中含有）
Tris 6.06 克 (終濃度為50 mM )
LiCl 6.03 克 (LiCl -H2O9.06克) (終濃度為150 mM )
EDTA（0.5 M） 10 毫升 (終濃度為5 mM )
SDS 50 克 (終濃度為5 % )
5、8 M Li Cl：33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC處理的ddH2O
1、 水飽和酚
2、 氯fang
3、 0.5M NaCl
4、 溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心。
10、點(diǎn)樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油。
二、器材
1、 分光光度計(jì)
2、 電泳儀
3、 臺(tái)式離心機(jī)
4、 手提式紫外監(jiān)測(cè)儀
5、 恒溫水浴
6、 凝膠成像系統(tǒng)
四、操作步驟
1、取植物葉片1-3克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分裝，小量提取試劑量可減至1／10)
2、液氮揮發(fā)完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的離心管中，迅速反復(fù)倒置混勻，直至看不見(jiàn)任何團(tuán)狀物為止。
3、立即加入10毫升的等體積（酸性）酚/氯fang，劇烈（！）反復(fù)倒置混勻5至10min（如在震蕩器上震蕩，要確保混勻而不能僅僅是振動(dòng)?。?/span>
4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。
5、重復(fù)步驟3和4，三次左右（注意觀察界面上白色物質(zhì)）。
6、取上清，加入等體積的氯fang，反復(fù)倒置混勻2-5min。
7、13000g×5min。
8、取上清，加入1/3體積8 M 的 LiCl （即8 M LiCl應(yīng)占后體積的25%）， 沉淀RNA，4℃過(guò)夜。
9、離心13000g × 10 min。
10、棄上清,保留沉淀（此時(shí)應(yīng)把RNA沉淀轉(zhuǎn)入Eppendorf管中，以便于操作）, 加入70%無(wú)水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗滌沉淀數(shù)分鐘（和緩地反復(fù)倒置混勻），離心 （13000g × 2 min）。重復(fù)洗滌沉淀數(shù)次。
11、用70%乙醇再洗滌2次沉淀，去掉鹽離子。
12、用槍頭吸去殘留的液體，真空干燥2min。
13、加入200ulDEPC 處理過(guò)的水溶解RNA。
14、取用5ul電泳檢測(cè)RNA完整性, 用TEB 緩沖液, 200V× 20-30min。
15、取5 ul稀釋40倍測(cè)定RNA純度和濃度，A260 nm /A280 nm應(yīng)在 2.0 左右。
16、將RNA 分裝,放在-70℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?/span>.
輔助方案：試劑盒提取法（Trizol）
（一）試劑：
1.Ttizol Reagent
2.氯fang
3.異丙醇
4.70%無(wú)水乙醇
5.DEPC
（二）器材：
1、研缽
2、離心機(jī)
（三）實(shí)驗(yàn)步驟
1、稱(chēng)取小麥葉片50-100mg,于研缽中加液氮研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。
2、加入1 ml Trizol Reagent，15～30℃×5min。
3、加入0.2ml氯fang，劇烈振蕩15 sec，15～30℃×3min。
4、冷凍離心12 000 rpm×15min。
5、將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中，加0.5ml預(yù)冷異丙醇,混勻 ，-20℃放置20min。
6、冷凍離心12 000 rpm×10min。
7、加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀，懸浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。
加入30 ul DEPC 處理過(guò)的ddH2O溶解RNA。
