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遠(yuǎn)慕手把手教您細(xì)菌總蛋白和膜蛋白提取方法!!
點(diǎn)擊次數(shù):1953 更新時間:2018-10-26

       細(xì)菌蛋白是以碳?xì)浠衔?如天然氣或?yàn)r青)或甲醇作為底物,它們的蛋白質(zhì)含量占干重的3 /4 以上,必需氨基酸的組成中同樣缺乏含硫氨基酸,另外,它們所含的脂肪酸也多為飽和脂肪酸。用來生產(chǎn)細(xì)菌蛋白的主要有桿菌屬(Bacilus) 和絲菌屬(Nocardia )、微球菌屬(Microcus) 和假單胞菌屬(Pseudomonas ),并已經(jīng)有工業(yè)化生產(chǎn)的先例。生產(chǎn)細(xì)菌蛋白的菌種主要以光合細(xì)菌為主,包括似真細(xì)菌的紅螺細(xì)菌、綠硫細(xì)菌、著色細(xì)菌及似藻的藍(lán)細(xì)菌。

一、從新鮮樣品中提取總蛋白(簡易法)

1、自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5% Triton X-100,調(diào)pH值至8.5-9.0備用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1μl/ml 的蛋白酶抑制劑PMSF。該裂解液用量為10-50ml 裂解液/1g濕菌體。

2、將40ml 菌液在12000g,4℃下離心15分鐘收集菌體,沉淀用PBS懸浮洗滌2遍,沉淀加入1ml裂解液懸浮菌體。

3、超聲粉碎,采用300w,10s超聲/10s間隔,超聲20min,反復(fù)凍融超聲3次至菌液變清或者變色。

4、1000g離心去掉大碎片,上清可直接變性后PAGE電泳檢測,或者用1% SDS溶液透析后凍存。

缺點(diǎn):Western blotting結(jié)果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、從Trizol裂解液中分離總蛋白

1、Trizol溶解的樣品研磨破碎后,加氯fang分層,2-8℃下10000g離心15min,上層水相用于RNA提取,體積約為總體積的60%。

2、用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml無水乙醇混勻,室溫放置3min,2-8℃不超過2000g離心5min。

3、將上清移至新的EP管中,用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml Trizol加入1.5ml異丙醇,室溫放置10min,2-8℃下12000g離心10min,棄上清。

4、用含有0.3M 鹽酸胍的95%乙醇洗滌。每1ml Trizol加入2ml洗液,室溫放置20min, 2-8℃下7500g離心5min,棄上清,重復(fù)洗滌2次。后加入2ml無水乙醇,渦旋后室溫放置20min,2-8℃下7500g離心5min,棄上清。

5、冷凍干燥5-10min,1%SDS溶液溶解,反復(fù)吹打,50℃溫浴使其*溶解,2-8℃下10000g離心10min去除不溶物。

6、替代方案:將3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中,在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次,1000g離心10min去除沉淀,上清可直接用于蛋白實(shí)驗(yàn)。

三、從新鮮樣品中提取疏水性膜蛋白(Triton X-114去污劑法)

1、配制疏水性蛋白提取液(非裂解液):1% Triton X-114,150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,1mM EDTA,調(diào)pH值至8.0備用。

2、菌液于4℃條件下15000g離心15min收集菌體;用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗滌3次,后于4℃條件下15000g離心15min收集菌體。

3、菌體沉淀加入1ml冷提取液,于4℃條件下放置2h,17000g離心10min,去除沉淀取上清。

4、將上述上清中的Triton X-114含量增加到2%,再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性,37℃條件下放置10min使其分層。室溫下1000g離心10min使液相和去污相充分分層。

5、將液相和去污相分開,分別用10倍體積的冷丙酮在冰上沉淀45min。

6、于4℃條件下17000g離心30min,用去離子水洗滌沉淀3次。

7、將沉淀溶解在1% SDS溶液中,測定蛋白濃度,比較液相和去污相中蛋白提取效率,一般是去污相中疏水性膜蛋白較多,適于進(jìn)一步蛋白實(shí)驗(yàn)。

8、SDS-PAGE進(jìn)一步分析液相和去污相的蛋白圖譜。

 


 

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