Western Blot 即免疫印跡試驗，可以利用 Western Blot 來比較在不同條件下，不同細胞組織中目的蛋白表達量的差異，屬于定性，半定量試驗。既然有差異性比較，參照物*。Western Blot 試驗中的標(biāo)準(zhǔn)（表達量）參照物即內(nèi)參，有了參照物才能準(zhǔn)確地比較目的蛋白表達量的差異。內(nèi)參一般選用管家基因表達的蛋白，它們在各個組織細胞中表達相對恒定，不會因為外部條件變化而引起表達量的變化。而且內(nèi)參可以監(jiān)測整個試驗體系是否正常，比如蛋白提取過程，轉(zhuǎn)膜體系，顯色體系等。
beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等已作為成熟的內(nèi)參運用到試驗中，下面就大致介紹下如何選擇內(nèi)參：
樣本來源
● 如果是哺乳動物的組織或細胞，主要以 beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 為代表；
● 如果是植物樣本，主要以 actin、Rubisco 為代表。
目的蛋白定位
● 全細胞蛋白和細胞質(zhì)：beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 等；
● 細胞核蛋白: PCNA 等；
● 核膜蛋白：Lamin B1 等；
● 胞膜蛋白：Na(+)/K(+) ATPase 等。
目的蛋白分子量
beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 的分子量分別是 42kd，50kd，37kd，目的蛋白分子量hao能與內(nèi)參蛋白分子量相差 5kd 以上，才能分開目的蛋白和內(nèi)參，寫文章做圖也更美觀；
三大內(nèi)參
beta Actin，肌動蛋白，細胞骨架蛋白。它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。beta Actin 作為內(nèi)參是得到*的，針對大多數(shù)組織和細胞來說的，它廣泛分布于細胞質(zhì)內(nèi)，表達量非常豐富。但是在一些少量特殊的情況下比如脂肪組織和細胞內(nèi)，beta Actin 的表達量就很少。
GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，該酶是糖酵解反應(yīng)中的一個酶，幾乎在所有組織細胞中都高水平表達，在同種細胞或組織中的表達量一般是恒定的，且很少受外部誘導(dǎo)物的影響。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，會增加 GAPDH 在特定細胞和組織中的表達。
beta Tubulin，微管蛋白，細胞骨架蛋白。作為內(nèi)參抗體，beta Tubulin 表達通常不會發(fā)生改變，因此被廣泛用于 Western Blot 內(nèi)參，也常被用于免疫染色觀察細胞的微管結(jié)構(gòu)。
下面是多年項目經(jīng)理在開發(fā)抗體時的一點心得，希望對大家有幫助。
1. 不同的內(nèi)參在選擇上也要根據(jù)具體的樣本情況選擇，沒有一種內(nèi)參能適用所有的組織和細胞樣本。比如，血紅細胞（因為其細胞結(jié)構(gòu)的特殊性和需要攜帶氧氣的功能性）樣本就不適合以上 3 種常用內(nèi)參。如果使用會導(dǎo)致結(jié)果很差或者沒有結(jié)果?？梢赃x用血紅細胞的結(jié)構(gòu)性蛋白作為內(nèi)參代替。
2. 在做多組織多細胞樣本對比表達量時，hao選用 GAPDH 作為內(nèi)參，因為 GAPDH 是代謝類蛋白，在活組織中表達比較恒定。而 beta Actin 和 beta Tubulin 是結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細胞結(jié)構(gòu)會有差異性，如腦組織的 tubulin 的表達會高一些（因為神經(jīng)細胞的軸突和樹突都由 tubulin 維持結(jié)構(gòu)），而 actin 的表達量可能會低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而導(dǎo)致了 tubulin 的表達改變和特化。心肌的 beta Actin 的表達量可能變少，而 alpha Actin 表達量高。因為這些組織的差異，現(xiàn)在慢慢采用總 Actin 和總 tubulin 作為內(nèi)參，可以盡量減少一些組織表達量差異。
3. 做各種分泌液樣本的時候，如血漿，乳汁，組織液等，以上的 3 種內(nèi)參也不是很合適。由于沒有完整的細胞結(jié)構(gòu)，所以只能選擇一些分泌蛋白作為內(nèi)參，或者采用其他方式作為內(nèi)參。
4. 做誘導(dǎo)后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時，選擇結(jié)構(gòu)蛋白作為內(nèi)參，如 beta Actin 和 beta Tubulin。因為 GAPDH 是代謝類蛋白，表達量有可能會受到誘導(dǎo)處理的影響。同時，做修飾性抗體的 Western Blot 實驗，hao也帶上同抗原的總抗作為陽性對照。
5. 做 Western Blot 實驗時，內(nèi)參的條帶強度也要適當(dāng)控制。不要讓內(nèi)參條帶發(fā)生過度曝光的情況，尤其是用 X 膠片曝光的。如果內(nèi)參條帶過度曝光，條帶會顯得很寬，妨礙對條帶正確強度的判讀，進而影響對其他實驗結(jié)果的判斷。hao的內(nèi)參結(jié)果是： 窄窄的，黑色實心條帶。
