隨著蛋白類生物制品的發(fā)展，蛋白質純度已經成為藥品管理的重大問題。在生物制品的質量指導原則中指出：除了評價原料藥和藥物產品的純度，可能由預期產品和多種產品相關物質組成之外，還應評價可能出現(xiàn)的雜質成份。這些雜質可能是在生產過程中產生的或者是與產品相關，它們的結構可能是已知的、定性的，亦或是未知的。

在評價樣品純度之前，首先要鑒定待測雜質的類型，如核酸、碳水化合物、脂質、無關蛋白質、同工酶類、失活蛋白質，進而確定在待測溶液中，能夠區(qū)分假定雜質和目標蛋白質的理化性質(化學分析或物理特征)。純化過程中可能已將某一雜質的濃度降低到檢測限以下，但色譜峰中還有殘留。毫無疑問，表觀純度取決于所選擇的測定方法及其靈敏度。大多數的分離方法都能有效的去除非蛋白類雜質，下面遠慕生物簡單介紹蛋白質樣品中蛋白類雜質的檢測方法。

1、電泳法

電泳法最jian單、成本最di，并且在確定樣品中蛋白質組分數目方面靈敏度最高，因此最為常見。通常被用于蛋白質純度鑒定的第一步篩選，甚至應用于初期高異質性的樣品鑒定。如果預期雜質與目標蛋白的分子量有差距，SDS凝膠電泳可以分辨出雜質。對于分子量相近但氨基酸組成不同的分子，SDS凝膠電泳一般分不開，但在非變性凝膠電泳中可以根據其不同的電泳遷移率進行鑒定。

然而，在采用該方法時也需要注意一些潛在的問題。對于變性凝膠，可能出現(xiàn)假陰性和假陽性現(xiàn)象。如果發(fā)生雜質共遷移或雜質無法進入凝膠的情況，會出現(xiàn)假陰性。因此應該將整塊膠，包括濃縮膠和分離膠都染色，并且需要檢驗蛋白質燃料是否合適。而假陽性的產生，可能是由于在樣品制備時發(fā)生共價修飾，或者膠不均一或氧化劑殘留。同時在非變性凝膠中也會出現(xiàn)類似問題。如果雜質的靜電荷為零或者與目標蛋白相反，雜質將不會出現(xiàn)在膠上，可以通過加寬非變性凝膠電泳的PH范圍來解決。

2、色譜法

2.1 凝膠過濾色譜法

凝膠過濾色譜法是檢測與目的蛋白分子量大小不同雜質的最簡jian單方法之一。此方法無破壞性并且非常快速。因為此方法為樣品區(qū)分法，樣品通過凝膠柱時會被稀釋，因此檢測的樣品需要有一定的起始濃度。而具體的檢測量則取決于檢測雜質時的靈敏度。

凝膠過濾色譜法檢測分子大小的靈敏度低于電泳法，實驗需要的材料量大于電泳法。由于凝膠過濾色譜通常在天然狀態(tài)下進行，結果可以反映樣品的異質性。但如果蛋白質以穩(wěn)定的寡聚物形式存在(如脂肪酸酶)，在凝膠過濾色譜時將表現(xiàn)出異質性。同時，快速、可逆自聯(lián)作用的蛋白質也會表現(xiàn)出異常濃度的洗脫譜。在出現(xiàn)這樣情況的時候，可以從不對稱或加寬峰中選取不同部分來重復凝膠過濾色譜。

2.2 反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜法（reversed phase HPLC），是利用如改性硅介質等非極性基質作為固定相，通過流動相中的有機溶劑減少了蛋白質與固定相的親和力，進行極性遞減的梯度洗脫，從而將蛋白洗脫下來。

由于該方法簡單并且迅速，同時有現(xiàn)成的儀器設備，能夠靈活應用于多種不同特性的蛋白質分離，因此此方法已普遍用于蛋白質樣品的純度測定。如果有需要，還可以通過改變流動相使樣品在不同梯度及條件下分離，來確定主要目標物的純度。

3、沉降速率測定法

沉降速度法，能夠簡單并且快速非破壞性的來測定蛋白質的純度，同時對分子質量和分子大小的比值非常靈敏。該方法的優(yōu)點在于，測定范圍非常的廣；但局限在于，對相對分子質量相差小的樣品做測定時，靈敏度低于電泳技術。

4、質譜法

質譜法可以直接測定一個樣品中共價質量的分布，此方法能夠方便簡便、靈敏的測定雜質。質譜法不僅可以檢測雜質的存在，還可以描述雜質的質量特征，因此質譜法常被用于鑒定雜質的來源。通過串聯(lián)質譜法（MS/MS），可以鑒定共價改性修飾特征和位點。由于雜質可能與主要目標物有相似的質荷比，將質譜法與其他方法(如凝膠分離色譜)聯(lián)用，可以增加樣品純度測定的準確性，達到最佳的效果。

5、光散射法

目前一些儀器能夠通過靜態(tài)或動態(tài)光散射來測定單個樣品，或者監(jiān)測高效液相色譜和場級分離過程。通過對分子大小和表觀分子質量的連續(xù)測定，增強鑒定洗脫蛋白質的能力，以區(qū)分待分析物、待分析物的多聚體或雜質。光散射法非常簡單且無破壞性，同時能夠提供洗脫時間函數的分子質量圖。如果紫外檢測峰不對稱，通過多角度光散射（multiple angle light scattering，MALS）分析，有可能表現(xiàn)峰的主要部分表觀分子量為mol/L，而邊緣為2mol/L，說明可能存在二聚體。但出現(xiàn)倍數分子質量不一定能證明一定存在自身結合，還需要采用不同的方法驗證此結果。

任何方法都不能直接定量蛋白質樣品的純度。通常情況下，蛋白質純度測定涉及評價待定雜質的含量或僅僅驗證蛋白質樣品中是否存在雜質。無論最終目的是為了解釋分析數據、驗證過程質量，還是為了確保生物制劑產品的安全性，樣品純度的測定都是至關重要的環(huán)節(jié)。