1．目的

學(xué)會(huì)用限制性?xún)?nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA。

2．原理

II型限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部的特殊序列并在識(shí)別位點(diǎn)處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過(guò)電泳酶切后的DNA混合物能夠確認(rèn)和分離酶切片段。

3．器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，水漂，恒溫水浴。

4．試劑

Pinpoint?xa-3質(zhì)粒，EcoR V，BamH I，內(nèi)切酶緩沖液（10×），10×電泳加樣緩沖液，熒光染料。

5．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

配制TAE電泳緩沖液（50?儲(chǔ)存液），10?加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）。

6．操作步驟

（1）混合下列溶液于一個(gè)無(wú)菌的1.5ml微量離心管中：

Pinpoint?xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl

10×酶切緩沖液（用EcoRV的緩沖液） 2 μl

ddH2O 30 μl

EcoRV 1μl

BamHI 1μl

總體積 40μl

（2）先準(zhǔn)備一個(gè)冰盒并放入一定量的冰塊。從-20℃冰柜中取出限制性?xún)?nèi)切酶，立即插入冰塊中。

（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部（以免手指的給酶液加溫），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μl限制性?xún)?nèi)切酶。

（4）在酶切樣品混合液中加入限制性?xún)?nèi)切酶后（立即把內(nèi)切酶原液送回冰柜?。p輕震動(dòng)微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機(jī)中1000rpm離心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推薦的最適酶切溫度水浴中溫育1~3 h（一般是 37℃）。

（5）酶切后取少量酶切產(chǎn)物與合適的已知分子量的DNA（如先前的PCR產(chǎn)物）對(duì)比電泳，以確認(rèn)切下的片斷是否為自己想要的片斷。

（6）酶切后的質(zhì)?？梢曰厥諅溆茫ㄒ?jiàn)實(shí)驗(yàn)六：從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段）。

（7）清理桌面垃圾，清洗實(shí)驗(yàn)儀器。撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。